专访陈守文丨产量高达6.24g/L，湖北大学团队改造地衣芽胞杆菌从头合成2-苯乙醇，有望实现工业化生产

2 - 苯乙醇是一种具有玫瑰花香的芳香醇，因其独特的香气，被誉为无可替代的 "至上的调和剂"，因此作为香精香料广泛应用于食品和化妆品等领域，是最为广泛的大宗香料之一。同时，2 - 苯乙醇还能作为前体合成其他香精香料。此外，2 - 苯乙醇还用于航空燃料助推剂和抗菌剂，在航空和医药领域具有良好发展前景。

目前，工业化合成 2 - 苯乙醇主要是通过化学方法合成。但化学合成法生产 2 - 苯乙醇工艺繁琐，且易造成环境污染，而且合成 2 - 苯乙醇的原料苯和苯乙烯均为致癌物质，化学合成的 2 - 苯乙醇在食用香精香料中使用受到严格限制。植物提取法受玫瑰等原料限制，提取工艺复杂且成本高。微生物合成 2 - 苯乙醇具有反应条件温和、原料可再生、产物天然、纯化工艺简单等优势。因此，实现微生物发酵生产 2 - 苯乙醇将有助于 2 - 苯乙醇相关产业快速发展。

近日，湖北大学生命科学学院陈守文教授在合成生物学和代谢工程领域顶级期刊 Metabolic Engineering 发表了题为 "Multilevel Metabolic Engineering of Bacillus licheniformis for De Novo Biosynthesis of 2-Phenylethanol" 的研究论文，湖北大学生命科学学院博士后占杨杨为第一作者。

图丨占杨杨（来源：占杨杨提供）

借此机会，生辉 SynBio 邀请到了陈守文老师与我们分享他的研究进展和科研项目。

陈守文于 1989 年本科毕业于华中师范大学生物学专业，1992 年从华中农业大学硕士毕业后留校，并于 1995-1998 年在无锡轻工业大学（现江南大学）攻读发酵工程专业博士学位。

博士毕业后，陈守文回到华中农业大学从事芽胞杆菌发酵工程和基因工程育种等相关工作，成为农业部农业微生物重点实验室主任喻子牛教授团队一员，并于 2006 年获国家科技进步二等奖（第二完成人），2014 年获得湖北省科学技术发明一等奖（第一完成人）。

自 2014 年来湖北大学任教至今，陈守文课题组研究方向聚焦于地衣芽胞杆菌生物技术及合成生物学相关研究。目前主要研究方向包括地衣芽胞杆菌的代谢组学、代谢工程、酶工程及发酵工程等，研究产物包括聚 γ- 谷氨酸、杆菌肽、脂肽、乙偶姻、 2,3 - 丁二醇、缬氨酸、异丁醇、芳香族氨基酸及其衍生物（2 - 苯乙醇、酪醇、羟基酪醇、天麻素和红景天苷等）、核苷类物质（肌苷、鸟苷和核黄素等）、和工业酶及生物医药工具酶等。

"喻子牛教授团队有很好的苏云金芽胞杆菌分子生物学基础，2002 年左右，我们开始利用枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌合成聚 γ- 谷氨酸。在与华北制药集团技术转让的机缘巧合下发现枯草芽胞杆菌容易染噬菌体，地衣芽胞杆菌不易染噬菌体，而染噬菌体后会导致发酵失败。基于此，在苏云金芽胞杆菌分子生物学平台基础上，启动了地衣芽胞杆菌的代谢工程育种。" 陈守文告诉生辉 SynBio。

图丨陈守文（来源：陈守文提供）

2 - 苯乙醇产量可达到 6.24g/L

传统的 2 - 苯乙醇生产方法有化学合成法和植物提取法，但这两种方法均有一定缺陷。微生物合成 2 - 苯乙醇生产成本较低，产量高，并且获得的 2 - 苯乙醇纯度较高且不含有毒有害杂质，利用微生物法将是合成 2 - 苯乙醇是未来发展趋势。

自然界中多种微生物具有合成 2 - 苯乙醇的能力，如毕赤酵母、马克思克鲁维酵母、芽枝状枝霉和帚状地霉等都能在发酵过程中从头合成一定量的 2 - 苯乙醇。但微生物合成 2 - 苯乙醇的方法仍很难实现工业化大规模生产，原因有三点，其一，2 - 苯乙醇对微生物细胞具有较强毒性；其二，原有艾利希途径效率较低；其三，正常条件下不到  5%  碳通量流向芳香族氨基酸的合成。

为解决上述难题，陈守文团队利用地衣芽胞杆菌作为底盘细胞，通过基因挖掘和酶学分析，耗时一年半左右筛选并鉴定了一个高效转化苯乙醛合成苯乙醇的内源性醇脱氢酶，建立杂合型艾利希途径，实现 2 - 苯乙醇的异源高效合成。

艾利希途径:
在酵母菌株里存在天然艾利希途径（Ehrlich pathway），艾利希途径是由酮酸脱羧酶和醇脱氢酶两个酶组成，可以生成多种支链醇和芳香醇化合物。由于地衣芽胞杆菌缺乏酮酸脱羧酶，需要异源引入，但自身存在内源性的醇脱氢酶，因此，将构建的艾利希途径称为杂合型艾利希途径。

随后通过模块化代谢工程分别系统改造中心代谢、莽草酸合成代谢、2 - 苯乙醇竞争和葡萄糖转运途径，使得 2 - 苯乙醇合成途径的碳代谢流通量大幅提高。最后，优化发酵工艺使得最佳菌株地衣芽胞杆菌 PE23 合成苯乙醇产量高达 6.24g/L，为目前从头合成 2 - 苯乙醇报道的最高水平。

图丨代谢工程改造地衣芽胞杆菌合成 2 - 苯乙醇（来源：研究论文）

"地衣芽胞杆菌具有很强的蛋白酶和淀粉酶高产能力，在土壤中具有较强竞争优势，同时在生长的过程中也会代谢生产肽类抗菌物质如脂肽、抗菌肽等，抑制植物病原菌，提高植物的抗病力。" 陈守文说道。

他补充道，"同时它还被视为生物安全性菌株，生长快，能够利用各种原料进行生长，具有环境胁迫耐性强等优势，已被广泛应用于生产多种生物基化学品，如聚 γ- 谷氨酸、杆菌肽、碱性蛋白酶、纳豆激酶、乙偶姻和 2,3 - 丁二醇等。"

但该菌株无法有效表达富含二硫键的蛋白，胞内外蛋白酶活性强，导致异源酶表达容易受宿主影响。另外地衣芽胞杆菌生物信息和分子编辑工具不完善，遗传转化效率低，作为底盘细胞改造的效率较低。

有望替代传统的 2 - 苯乙醇生产模式

"本研究有效解决了地衣芽胞杆菌芳香族代谢产物合成碳通量低的问题，论文中构建的 2 - 苯乙醇合成相关代谢通路是完全适用于大肠杆菌等底盘细胞的，筛选到的广谱性活性强的醇脱氢酶可推广至其他微生物底盘用于合成系列醇。"

"该研究有望替代传统 2 - 苯乙醇合成模式，实现 2 - 苯乙醇的绿色、可持续生产，也为其他芳香族衍生化学品的发酵生产奠定基础。" 陈守文表示。

他计划在此研究基础上，借助蛋白质组和代谢组学分析进一步挖掘限速步骤，并通过适应性进化进一步提高菌株对 2 - 苯乙醇的耐受性，最后通过发酵罐放大，结合膜分离纯化技术，实现 2 - 苯乙醇的工业化生产。

在此底盘细胞的基础上，进一步拓展路线，对苯丙氨酸、酪氨酸、多巴、酪醇、羟基酪醇和红景天苷等系列相关产物进行代谢工程育种，实现更多高附加值芳香族天然产物的微生物制造。

陈守文说道，"首先，芳香族天然产物代谢途径涉及 EMP 途径、HMP 途径和三羧酸途径，在合成芳香族天然产物时要考虑其代谢途径、芳香族天然产物自身的反馈调控和反馈抑制，针对不同途径进行阻断和强化。"

"以芳香族氨基酸为例，其有色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸三种，合成每个氨基酸的酶不一样，走的路径不一样，分叉点很多，所以需要考虑如何让它走向更有效的路径。"

目前在合成芳香族天然产物途径上，陈守文团队已合成了很多产品，如 2 - 苯乙醇、前体物莽草酸和芳香醇糖苷。

作为从教二十多年的科研工作者，陈守文在科研和培养学生方面也有一些自己的见解。他认为，做科研最重要的是专注和热爱，专注于自己的研究领域并持续耕耘。而在培养学生方面，他表示要引导学生树立正确的人生观和科研观，引导学生积极主动投入更多的精力到科研工作中，从实验设计、专业实验、科研总结、科技写作等方面全面培养学生独立科研工作能力。

参考资料：

• https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1096717622000131?via%3Dihub
• https://cjb.ijournals.cn/html/cjbcn/2021/6/gc21061998.htm
• https://image.hanspub.org/Html/698.html

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